文献标识码：A
文章编号： 0258-7998(2014)06-0070-04
癌细胞分选仪是对细胞样品进行癌细胞检测、计数、分选以及分析的装置。现代基于流式细胞术的流式细胞分选仪或分析仪通过激光激发荧光的方式[1]，检测细胞的荧光和散射光来获取细胞的参数，并通过分析参数对细胞进行计数或分选等操作。这种方式具有检测精度高、分析速度快、分选率高等优点，得到了广泛的应用[2]。
传统的细胞分选仪大多是基于石英管和毛细管等平台，具有集成度比较低、耗费样品量大的缺点[3]。新兴的微流控芯片通过微机电技术(MEMS)，将细胞处理、检测与分选等操作集中在一块芯片上，大大提高了集成度，并且耗费样品低，是一种应用前景广阔的技术[4]。本文在微流控芯片的平台上，设计了癌细胞分选仪的硬件系统，完成了癌细胞荧光检测电路与用于微流控芯片内细胞分选的高压脉冲源设计，实现了在微流控芯片上癌细胞检测、计数以及分选的结合。
1 系统结构
整个仪器包括液滴产生系统、微流控平台与激发光路、主控电路、荧光检测电路、高压脉冲源和细胞分选系统。系统的结构如图1所示。
液滴生成系统通过恒流泵在微流控芯片内通过流体聚焦将细胞包裹在液滴中并且在芯片沟道中快速流动，激光器(532 nm)发出的激光经过光路聚焦到芯片沟道一个点上，对癌细胞进行荧光激发。
使用北京滨松公司生产的电流输出侧窗型光电倍增管(PMT)进行荧光检测[5]，将光信号转换为微弱负电流信号，然后通过荧光检测电路的放大、滤波、A/D转换传送到主控电路，主控电路对信号进行分析并判断是否让高压系统产生高压脉冲进行细胞分选。
系统主控电路采用Atmel公司的Atmega128芯片作为主控芯片，完成与PC通信、采集与处理荧光数据、高压分选系统等功能。
微流控平台示意图如图2所示。整个微流控芯片包括进样口、液滴产生沟道(图中未画出)、主沟道、正负电极、分选沟道等部分。电极做在沟道两侧并与沟道处于同一高度，以产生垂直于沟道的均匀电场。
图2微流控芯片示意图
2 荧光检测电路设计
荧光检测电路用于检测PMT输出的微弱负电流信号。癌细胞产生的荧光信号比较微弱，PMT输出的负电流范围为数百皮安~数微安。这要求前置放大电路具有低噪声、高精度的特性[6]。整个荧光检测电路包括前置变阻放大、滤波电路、DAC电路。
前置放大电路采用变阻放大的电路结构，如图3所示。电路的直流增益倍数取决于反馈电阻R2，根据Vout=Iin·R2可以计算前置电路输出电压。由相关文献可知[7]，采用一级放大可以获得最高的信噪比。为了避免输入屏蔽电缆的寄生电容[8]引起电路振荡，在电路设计中加入电容C1,用以补偿信号的相位。反馈电阻R2并联合适的反馈电容C2，限制信号的带宽。R3和C3在信号回路中形成一个低通滤波器，抑制由于背景光引起的噪声和电阻R2的热噪声，同时避免了产生很大的负载效应[9]。
图3 前置放大电路
由于要检测微弱的负电流信号，所以对于运算放大器U1有较高的要求。运放应当具备极小的输入偏置电流、噪声低和较大带宽增益积的特性。综合以上考虑，设计中选择了美国Linear公司的CMOS输入型精密运放LTC6240HV，该运放的性能参数有：(1)0.1 Hz~10 Hz噪声为550 n Vp-p；(2)输入偏置电流IB：典型为0.2 pA，最大为1 pA；(3)带宽增益积：18 MHz。在实际的电路测试中，该运放对弱电路的检测能力满足系统对检测精度的要求。
3 可调高压脉冲源设计
设计的高压脉冲源用于产生0~1 200 V范围的可变宽度的脉冲信号，形成垂直电场加在微流控芯片的沟道两侧，以分选检测到的癌细胞液滴。分选时通过调节脉冲的宽度和高度来达到最优的分选效果。
可调高压脉冲发生器的结构如图4所示，整个电路包括了可调直流高压模块，DAC高压调节电路、IGBT以及IGBT驱动电路等部分。电路采用两个IGBT组成半桥结构，采用悬浮驱动技术[10]，避免了采用单个IGBT时由于负载太轻而导致关断时放电太慢，形成下降沿不够陡峭的问题。通过单片机的控制信号控制IGBT驱动器，从而控制上下两个IGBT的导通与关断，形成脉冲宽度可调的脉冲信号。单片机控制DAC输出不同电平的高压调节信号控制高压模块，来获得0~1 200 V范围内的脉冲峰值。系统中采用的直流高压模块为恒博可调高压，输出电压为0~1 200 V，IGBT为FGA25N120ANTD，耐压值为1 200 V, IGBT驱动器采用exb841模块。
图4 可调高压脉冲源结构框图
在电路测试中发现，IGBT切换产生脉冲时,会产生比较大的电压尖峰，当设置的电压较高时，产生的电压尖峰很可能会对电路元件产生损坏，因此在电路中加入了尖峰吸收与缓冲电路，如图5所示。
图5 尖峰吸收与缓冲电路
电路中D2与D3构成双向限幅电路，将驱动电压限制在-5 V~+15 V，R5与C8组成RC电路设定脉冲上升与下降时间，以消除电压尖峰，RC时间常数越大，消除尖峰效果越好，但同时脉冲上升与下降时间变长，测试中发现R5取10 Ω，C8取20 pF时，可以获得比较良好的消峰与脉冲边沿特性。D1与C7用于保护exb841内部的稳压管。
4 系统测试
4.1荧光检测电路测量精度测试
直流信号下，检测电路输出的结果与五位半万用表测量结果相比，偏差小于50 μV。
在电路悬空输入(输入电流为零)情况下测试电路噪声与分辨力，当采样率为10 Hz时，得到的输出噪声曲线如图6所示。可以看到在此采样率下电路本身噪声Vp-p小于5 μV，根据反馈电阻为100 kΩ，等效输入电流噪声为50 pA，可认为电路具有100 pA量级的输入电流信号分辨能力，满足系统的测量要求。采样率上升时，ADC引起的噪声会有所增加。
图6 电路噪声测试
采用检测电路检测浓度为8×104/mL的乳腺癌细胞荧光曲线如图7所示。细胞悬浮液中的杂质会引起一些较低的峰，使用无癌细胞的悬浮液进行对比发现，杂质引起的峰一般小于400 mV，可以通过设定这个电压作为阈值来判断检测到的峰是否是细胞引起的。从图中可以看到，5 s内检测到了6个癌细胞。
图7 癌细胞荧光检测结果
4.2 高压脉冲信号源测试
经过单片机软件的线性偏差修正后，高压脉冲的峰值与预设值之间偏差小于1 V，具有较高的精度，满足系统的要求。
脉冲的上升时间和下降时间可以通过IGBT的基极串联电阻来调节,以取得脉冲过冲尖峰大小和上升、下降时间大小的平衡,在本设计中取基极串联电阻为10 ?赘，得到的1 200 V左右时脉冲上升下降波形如图8所示。可以看到脉冲上升、下降时间都约为10 μs，脉冲源最高可以产生频率为20 kHz的高压脉冲信号。
图8 高压脉冲的上升、下降沿测试图
4.3 细胞分选的测试
用罗丹明液滴模拟带有癌细胞的液滴进行细胞分选。当检测到超过阈值的荧光脉冲时，系统经过一定时间后产生一个脉冲分选出对应的液滴。图9是在显微镜下观察到的一组结果。
从图9中可以看到,在电极上加上600 V、50 ms脉宽的高压脉冲后，待分选的液滴发生偏离，而其余的液滴不受影响,最后成功将待分选液滴分选到左侧的沟道当中。
图9 高压脉冲分选细胞测试图
设计的基于微流控芯片的流式细胞分选系统采用AVR单片机为核心处理器，完成了微弱细胞荧光的检测电路的设计、细胞分选高压脉冲电路以及控制电路设计，在单片微流控芯片上实现了癌细胞的检测、计数以及分选。系统的硬件部分已经初步完成，经过测试，硬件各方面的参数均能满足系统的要求，为后期系统的整合和优化打下了比较好的基础。
参考文献
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